تراریزش برنج با ژن مانیتول-1-فسفات دهیدروژناز (تولید کننده مانیتول) به منظور ایجاد تنظیم اسمزی توسط نانو ذرات طلا

در این پژوهش به منظور دستیابی به برنج تراریخته فاقد ژن نشانگر انتخابی ، ساخت پلاسمید بیانیpabrii-mtld حامل ژن مانیتول-1-فسفات دهیدروژناز (mtld) و فاقد ژن مارکر انتخابی در گیاه با پلاسمیدهایpcabmldii و ptra132 برای بهره گیری از آن در روش تراریزش توام( ( co-transformation با پلاسمید دارای ژن مقاومت به هیگرومایسین به عنوان نشانگر انتخابی در گیاه انجام شد. در روش تراریزش توام ژن مورد نظر و ژن نشانگر بر روی ناقل های پلاسمیدی متفاوتی واقع شده و به عنوان قطعات ناپیوسته به ژنوم معرفی می شوند. ژن مورد نظر و ژن نشانگر در طی تفکیک و نوترکیبی که در طول تولید مثل جنسی رخ می دهد از هم جدا می شوند .برش آنزیمی پلاسمید pcabmtldii با آنزیم های برشی ecori و bamhiمنجر به ایجاد قطعه 8/1 کیلوبازی گردید که شامل تمام ناحیه کدکننده ژن ساختاری mtld و توالی ترمیناتوری نوپالین سنتتاز و بدون توالی پیشبر بود. در ادامه، این قطعه 8/1کیلو بازی در جایگاه ecori وbamhi پلاسمید تغییریافته ptra132 وارد شد که در آن ناحیه کدکننده هیگرومایسین فسفوترانسفراز و توالی ترمیناتوری نوپالین سنتتاز حذف شده بود. در پلاسمید نوترکیب حاصل موسوم به pabrii-mtld، ژن mtld که با ساخت و تجمع مانیتول در سیتوپلاسم سلول باعث افزایش تحمل تنش های شوری و خشکی می گردد، توسط پیشبر 35s ویروس موزائیک کلم موجود در پلاسمید ptra132 هدایت می شود . صحت ساخت ناقل های پلاسمیدی نوترکیب حاوی ژن مانیتول- 1- فسفات دهیدروژناژ با استفاده از آنالیز هضم dna و با استفاد از آنزیم های برشی bamhi ، ecori ،hindiii وpsti ونیز آنالیز واکنش زنجیره ای پلیمراز مورد تأیید قرار گرفت. درادامه، پلاسمیدهای pabrimtld و ptra132 (حامل ژن hph) به کالوس های جنین زایی که از بذور رسیده منشا گرفته ودارای توان تقسیم سلولی وباززای بالایی بودند ، به روش ریزپرتابه معرفی شدند. سلول های تراریخته احتمالی از بافت های بمباران شده پس از 3 دوره گزینش(به فاصله 21-14 روز) در محیط کالوس زای n6 حاوی 50 میلی گرم در لیتر هیگرومایسین b شناسایی شدند. نهایتا کالوس های مقاوم به هیگرومایسین در محیط باززای ms حاوی50 میلی گرم در لیتر هیگرومایسین b باززا شدند. در این پژوهش چند گیاه برنج تراریخته که حامل هردو ژن mtld و ژن مارکر( (hphبودند به دست آمد و ادغام هردو ژن در این گیاهان برنج به روش آنالیز زنجیره ای پلیمراز تأیید شد.